›
›

Bài giảng Công nghệ sinh học dược

pdf 116 trang phuongnguyen 9790
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Công nghệ sinh học dược", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbai_giang_cong_nghe_sinh_hoc_duoc.pdf

Nội dung text: Bài giảng Công nghệ sinh học dược

  1. Cơng nghệ sinh học dược
  2. Cơng nghệ sinh học  Các kỹ thuật sử dụng các hệ thống sống để tạo ra sản phẩm  Truyền thống: Cĩ từ rất lâu, Dựa trên kinh nghiệm, vi sinh vật học  Cơng nghệ lên men  Hiện đại: Nửa sau thế kỷ 20, dựa trên sinh học phân tử, sinh học tế bào, hĩa sinh,  Cơng nghệ gen  Cơng nghệ enzym-protein  Cơng nghệ tế bào
  3. Các giai đoạn phát triển  Thế hệ một: sản xuất các sản phẩm thực phẩm và nước uống lên men. Kỹ thuật được sử dụng bao gồm lên men, nuơi trồng và nuơi cấy mơ thực vật.  Thế hệ hai: sử dụng nuơi cấy tế bào hay nuơi cấy mơ để sản xuất. Sản phẩm của thế hệ này gồm kháng sinh, enzym, vitamin, acid amin. Kỹ thuật được sử dụng bao gồm đột biến và chọn lọc chủng vi sinh vật và phương pháp lên men, nuơi cấy để sinh sản phẩm tối ưu.  Thế hệ ba chính là CNSH hiện đại. Nĩ bao gồm các kỹ thuật tái tổ hợp di truyền. Ứng dụng cơng nghiệp của nĩ bao gồm dược phẩm, nơng nghiệp, hĩa chất, y học. Các sản phẩm hiện nay đang là các protein trị liệu, chẩn đốn, vaccin và cải tạo giống nơng nghiệp.
  4. Sự mở rộng nguồn gen  Cơng nghệ cổ điển tạo giống hay tính trạng mới dựa vào lai tạo, đột biến-sàng lọc:  Giới hạn trong phạm vi lồi và lân cận  Mất thời gian, hiệu suất khơng cao  Cơng nghệ hiện đại thao tác trên gen:  Cải tạo ở mức phân tử, dưới lồi  Khơng cịn giới hạn lồi  Nhanh và hiệu quả  Nguồn gen vơ tận
  5. Phạm vi ứng dụng  Cơng nghệ sinh học xanh (Green Biotechnology): CNSH áp dụng trong nơng nghiệp và xử lý mơi trường.  Cơng nghệ sinh học trắng (White Biotechnology): Sử dụng xúc tác sinh học và cơng nghệ lên men để tạo ra các sản phẩm cơng nghiệp như hĩa chất hay enzym.  Cơng nghệ sinh học đỏ (Red Biotechnology): CNSH ứng dụng trong y tế. Chẩn đốn và điều trị bệnh. Sản xuất dược phẩm.
  6. Các đặc điểm của CNSH  Đa năng  Địi hỏi mức độ nghiên cứu cao  Đa lĩnh vực  Cĩ tính hợp tác cao
  7. Đặc điểm của CNSHYD  Địi hỏi mức độ đầu tư cho nghiên cứu cao  Qui mơ vừa và nhỏ  Tỷ lệ đầu tư nghiên cứu cao hơn sản xuất  Cĩ tính phối hợp cao
  8. Sản phẩm của CNSHYD  Chẩn đốn y học  Sản xuất sinh phẩm chẩn đốn  Kỹ thuật chẩn đốn mới  Dự phịng bệnh  Vaccin  Thực phẩm chức năng  Điều trị bệnh  Liệu pháp gen  Liệu pháp tế bào  Huyết thanh, kháng thể  Sản xuất dược phẩm  Dược phẩm tái tổ hợp  Thuốc cĩ nguồn gốc sinh vật  Sản xuất thuốc bằng xúc tác sinh học  Nuơi cấy mơ, tế bào
  9. Các vấn đề của CNSH trong nước  Thiếu qui hoạch. Qui hoạch sai.  Đầu tư thấp.  Yếu kém trong phát triển nguồn nhân lực.  Bất hợp lý trong quản trị nhân lực.  Thiếu sự liên kết giữa cơ sở nghiên cứu và sản xuất.  Chưa cĩ cơ sở hạ tầng cơng nghiệp thích hợp.
  10. Cơng nghệ lên men
  11. Cơng nghệ lên men  Định nghĩa: quá trình biến đổi do vi sinh vật thực hiện trong điều kiện yếm khí hay hiếu khí  Sản phẩm  Sinh khối vi sinh vật  Enzym – protein vi sinh vật  Sản phẩm trao đổi chất: sơ cấp + thứ cấp  Các biopolymer và biosurfactant  Sản phẩm tái tổ hợp gen
  12. Chủng vi sinh vật 1: Khơng gây bệnh cho người, động vật và mơi trường (GRAS - Generally Recognized As Safe) 2: Cĩ thể gây khĩ chịu cho người, động vật và mơi trường 3: Gây bệnh, truyền bệnh nhưng cĩ cách chữa trị 4: Gây bệnh, truyền bệnh rất nhanh nhưng chưa cĩ cách chữa trị
  13. Thu nhận chủng  Phân lập từ mơi trường  “săn lùng” (shotgun)  cĩ định hướng (objective)  Ngân hàng chủng  Nhanh, ít tốn kém  Khơng cĩ tính cạnh tranh
  14. Yêu cầu của chủng cơng nghệ 1. Ổn định di truyền 2. Sản xuất hiệu quả sản phẩm mong muốn, và con đường sinh tổng hợp sản phẩm đã được khảo sát kỹ 3. Khơng cần hay ít cần các bổ sung vitamin và yếu tố tăng trưởng 4. Sử dụng được các cơ chất phổ biến và rẻ tiền 5. Cĩ thể biến đổi di truyền được 6. An tồn, khơng gây bệnh, và khơng sản xuất chất độc, trừ khi đĩ chính là sản phẩm 7. Dễ dàng thu hoạch từ quá trình lên men 8. Dễ dàng phá vỡ tế bào nếu sản phẩm là nội bào 9. Ít tạo ra sản phẩm phụ để thuận tiện cho việc tinh chế sản phẩm
  15. Cải tạo chủng  Tái tổ hợp tự nhiên  Gây đột biến  Đột biến ngẫu nhiên  Đột biến nhân tạo - cảm ứng  Sử dụng base tương đồng  Thay đổi về hĩa học của các base  Chiếu xạ  Gây đột biến bằng transposon  Lai ghép tế bào trần và biến nạp gen  Thao tác di truyền trên vi sinh vật
  16. Chiến lược thao tác di truyền  Sàng lọc gen từ tế bào nguồn  Cơ lập gen quan tâm: tạo dịng  Thực hiện các biến đổi cần thiết  Đưa gen trở lại tế bào đích  Kiểm tra và sàng lọc chủng mới
  17. Sàng lọc thể đột biến  Kiểu hình quan sát được  Khuyết dưỡng: cấy trên mơi trường tối thiểu  Tổng hợp gây chết  Kháng chất chuyển hĩa  Khĩm vệ tinh  Quang ứng động, hĩa ứng động  Khác biệt tỷ trọng: ly tâm phân đoạn
  18. Làm giàu thể khuyết dưỡng bằng penicillin Gây đột biến: Rửa và phân tán ở Thêm 100 U/ml 7 UV, HNO2, mật độ 10 /ml penicillin Nuơi cấy 5 h trong Ủ 5 h trong mơi Nuơi cấy 2-20 h mơi trường hồn trường glucose Loại bỏ penicillin chỉnh khơng chứa nitơ Pha lỗng đến 50- 100 tế bào/hộp Nhân bản Mơi trường Mơi trường Mơi trường hồn chỉnh tối thiểu hồn chỉnh
  19. Bảo quản giống vi sinh vật  Ngân hàng tế bào  Ngân hàng gốc (master cell bank)  Ngân hàng làm việc (working cell bank)  Cấy chuyền  Làm khơ  Đơng khơ  Đơng lạnh
  20. Mơi trường lên men  Cung cấp chất dinh dưỡng để tế bào phát triển  Chất dinh dưỡng  Yếu tố tăng trưởng  Cung cấp các chất cần thiết để thu sản phẩm  Sinh khối  Chất chuyển hĩa sơ cấp  Chất chuyển hĩa thứ cấp  Chất cảm ứng
  21. Các loại mơi trường lên men  Mơi trường tổng hợp: đĩ là mơi trường cĩ thành phần hĩa học chính xác về mặt định tính và định lượng.  Mơi trường phức hoặc bán tổng hợp: người ta chỉ biết thành phần chính xác của một vài hợp chất (về mặt định lượng đối với các chất cần quan tâm như yếu tố tăng trưởng, các thành phần khác dựa theo kinh nghiệm).  Mơi trường cơng nghiệp: nguyên liệu phức ban đầu chủ yếu bắt nguồn từ các sản phẩm nơng nghiệp hoặc từ sữa vì chúng rẻ và tương đối dồi dào.
  22. Tiêu chí chọn thành phần mơi trường  Giá thành và khả năng cung cấp.  Dễ xử lý, vận chuyển, và bảo quản với chi phí thấp.  Khơng gây khĩ khăn cho quá trình tiệt trùng và khơng bị biến chất.  Cĩ các thuộc tính vật lý như độ nhớt, khả năng trộn lẫn, khơng ảnh hưởng đến cơng thức chung, việc vận hành nồi cũng như xứ lý sau lên men.  Giúp đạt được nồng độ sản phẩm đích với tốc độ hình thành và năng suất sản phẩm trên gam cơ chất cao.  Nồng độ và loại tạp chất cũng như khả năng tạo sản phẩm phụ thấp khơng làm ảnh hưởng đến quá trình tách sản phẩm chính sau đĩ  Cĩ tính an tồn tốt
  23. Nguồn carbon  Ycarbon (g/g) = Sinh khối tạo ra (g) / Nguồn carbon sử dụng (g)  Mật mía  Cao chiết mạch nha  Tinh bột và dextrin  Nước thải sulfit  Cellulose  Bã sữa chua  Alkane và alcol  Chất béo và dầu
  24. Nguồn nitơ  Nước thải ngâm bắp  Cao nấm men  Peptone  Bã đậu nành
  25. Các thành phần khác  Nước  Khống chất  Vitamin và yếu tố tăng trưởng  Các tiền chất  Các chất cảm ứng và kích thích  Các chất ức chế  Chất thay đổi tính thấm tế bào  Oxi  Chất chống bọt
  26. Biện pháp kiểm sốt bọt  Thay đổi cơng thức mơi trường  Phá bọt cơ học  Các chất phá bọt: thường là các chất hoạt động bề mặt:  Nhanh chĩng phân tán và tác động nhanh  Tác động mạnh với liều thấp  Cĩ tác động kéo dài  Khơng độc đối với vi sinh vật lên men, người hay thú  Giá rẻ  Bền nhiệt  Tương thích với các thành phần mơi trường và qui trình
  27. Khí thải Hệ thống lên men vơ trùng Lọc tiệt trùng Cổng phụ  Cảm biến pH, nhiệt độ, oxi, bọt, mức Nước/hơi nước ra  Cung cấp oxi, chất dinh dưỡng, chất Trục khuấy kiểm sốt pH, Đĩa khuấy  Cánh khuấy Vỏ ngồi  Cổng thu hoạch Rọ cản Nước/hơi nước vào Khí vơ trùng Bộ phun khí Cổng thu Khí vào hoạch
  28. Các thiết bị nuơi cấy khác
  29. Các phương thức lên men  Kiểu vận hành  Lên men gián đoạn  Lên men bổ sung dinh dưỡng gián đoạn  Lên men liên tục  Độ kín của hệ thống  Lên men hở  Lên men vơ trùng  Sự thơng khí  Lên men hiếu khí  Lên men kỵ khí  Kiểu thiết bị sử dụng  Lên men nổi  Lên men chìm
  30. Lên men bề mặt 4 3 5 6 6 1 7 2 1-Giá đựng khay ; 2-Khay ; 3-Cửa cho không khí sạch vào buồng ; 4-Cửa cho không khí ra ; 5-Quạt ; 6-Chỗ phun nước ; 7-Bộ phận xả hơi nóng để điều chỉnh nhiệt độ của buồng.
  31. Lên men chìm Nguyên liệu Chuẩn bị môi trường Chuẩn bị môi trường Nhân giống cấp I lên men nhân giống Không khí ra Nhân giống cấp II, III Không khí ra LÊN MEN Không khí nén, lọc Tách và làm sạch sản phẩm
  32. Giám sát quá trình lên men  Các cảm biến in situ  Các bộ phân tích trực tuyến  flow injection analysis  sequential injection analysis  khối phổ (mass spectrometry - MS)  lỏng hiệu năng cao (HPLC)  sắc ký khí (GC)
  33. Sản xuất Kháng sinh
  34. Mở đầu  Hiện đã biết > 10 000 kháng sinh nhưng chỉ 200 được sản xuất và sử dụng thương mại  Việc tìm kiếm kháng sinh mới luơn tiếp diễn, quá trình R&D của 1 KS mới cĩ thể mất 15 năm  Sản xuất kháng sinh  Sinh tổng hợp - Lên men  Penicillin (V, G), Cephalosporin C  Macrolid, Aminosid, Tetracyclin,  Bán tổng hợp  Các Beta-lamtam khác  Tổng hợp hĩa học  Sulfamid  Quinolone
  35. Sản xuất penicillin  Giống  Penicillium notatum: do Fleming phân lập 1928, Florey và Chain xác định cấu trúc 1940  Penicillium chrysogenum: hiệu suất cao hơn, được cải tiến thành chủng cơng nghiệp ngày nay  Tốc độ tạo sản phẩm và hiệu suất cao  Nuơi cấy chìm  Sử dụng được cơ chất phức tạp và tiêu thụ tốt phenylacetat.  Khơng tạo sắc tố gây khĩ khăn cho việc tinh chế.  Cĩ hệ sợi sinh trưởng rắn chắc.
  36. Nhân giống  Thu lượng giống tinh khiết cần thiết ở pha tăng trưởng lũy thừa (logarit) cho giai đoạn lên men  Tiêu chuẩn  giống khơng nhiễm  mật độ tế bào đạt yêu cầu Bào tử Giai đoạn nuơi trong phịng thí Giai đoạn nuơi trong mơi ngủ nghiệm trên mơi trường rắn trường lỏng trong bình lắc giai đoạn giai đoạn giai đoạn nhân giống nhân giống sản xuất 0,5-1,0 m3 10-20 m3 125-250 m3 Giai đoạn nhân giống trong thiết bị
  37. Mơi trường lên men  Nguồn nitơ: nước thải ngâm bắp  Bổ sung thêm giữa chừng: amoniac  Nguồn carbon: glucose, sucrose và các dịch đường thơ,  65% để duy trì tế bào, 20–25% để tăng trưởng và 10– 12% cho sản xuất penicillin  Trước đây: Lactose  Canxi, magiê, phosphat, và các kim loại vi lượng  Tiền chất:  acid phenylacetic (G)  acid phenoxyacetic (V)
  38. Lên men  Nồi lên men: thùng khuấy 25-250 m3  Oxi: 0,5 - 1,2 vvm nhờ máy nén khí  Nhiệt độ: 26 1oC, cần thiết bị làm mát  Chế độ vận hành  Gián đoạn  Gián đoạn bổ sung dinh dưỡng, thu hoạch từng phần  Thời gian: 120-200 giờ  Kiểm sốt  Nhiệt độ  Oxi  Cân bằng nitơ/carbon pH  Kết thúc:  khi giảm hiệu suất chuyển đổi glucose penicillin  hiệu suất: 40 g/L
  39. Lên men Đường Penicillin
  40. Hậu lên men  Loại tế bào: lọc/ly tâm  Chiết penicillin  pH: 2-2,5, dung mơi: amyl acetate, butyl acetate và methyl isobutyl ketone  Chiết lại ở pH 7,5, dung mơi: nước  Loại sắc tố: than hoạt  Kết tinh  Thêm muối thích hợp (kali acetat)  Tẩy màu lại và rửa bằng dung mơi để tăng độ tinh khiết  Hiệu suất thu hồi: >90%  Giá thành: ~10 USD/kg
  41. Tĩm tắt qui trình Mơi trường Mẫu nhân giống Nước ngâm bắp Nồi lên P. chrysogenum Saccharose/glucose men Amoniac Khống Kiểm sốt pH Thu hoạch 1/3 và thay 1/3 mơi trường mới. 10 lần / 6 ngày Dịch lọc Lọc quay Tế bào nấm Chiết bằng butylacetat Thức ăn gia súc Tủa bằng muối kali Rửa / Lọc / Làm khơ Penicillin 99,5%
  42. Sinh tổng hợp cephalosporin C Expandase Penicillin N Deacetoxycephalosporin C Hydroxylase Acetyltransferase Cephalosporin C Deacetylcephalosporin C
  43. Lên men cephalosporin C  Lên men bổ sung dinh dưỡng gián đoạn A. chrysogenum.  pH 6.0 - 7.0, nhiệt độ 24 - 28oC.  Mơi trường:  Nguồn carbon:  Glucose giúp tăng trưởng nhanh nhưng giảm năng suất. Chỉ cung cấp vào giai đoạn đầu.  Galactose và sucrose: tăng trưởng chậm, năng suất cao hơn  Thay dần đường bằng dầu đậu nành hay đậu phọng: giảm glucose, giúp hình thành bào tử đốt và cephalosporin C. Dầu cĩ tác dụng chống bọt  Nguồn nitơ: bột đậu nành, hạt bơng cĩ bổ sung amonium sulfate. Ammoniac cĩ thể dùng để kiểm sốt pH  Nước ngâm bắp hay dùng làm nguồn nitơ và khống chất, vitamin.  DL-Methionine: cảm ứng hình thành bào tử đốt  Thơng khí:  Cyclase và expandase cần oxi để xúc tác: nếu oxi hịa tan giảm <20% penicillin N sẽ tích tụ và hiệu suất cephalosporin C sẽ giảm  Thêm acetyl esterase (Rhodosporidium toruloides): tích tụ deacetylcephalosporin C (bền) tăng năng suất
  44. Thu hồi cephalosporin C  Dùng cột than hoạt / cột nhựa khơng ion  cephalosporin C được hấp phụ chọn lọc so với penicillin N, deacetylcephalosporin C, and deacetoxycephalosporin C  Đánh bĩng bằng sắc ký trao đổi anion  Tạo dẫn xuất tetrabromocarboxybenzoyl cephalosporin C  Kết tinh từ dịch nước acid / tạo muối với base hữu cơ+chiết tách bằng dung mơi  Thích hợp thu hồi làm nguyên liệu bán tổng hợp
  45. Sản xuất các beta-lactam khác  Cephalosporin C, cephamycin C và penicillin được dùng để sản xuất các khung cho việc bán tổng hợp các beta-lactam khác 6-APA
  46. Sản xuất các khung để bán tổng hợp  6-APA: thủy phân Penicillin  Hĩa học: chiếm ưu thế từ 1970, nhưng hiện gặp nhiều vấn đề về mơi trường, dung mơi và tốn năng lượng  Enzym: được sử dụng từ 1960, nhưng ngưng do giá thành và vấn đề tái sử dụng. Đến 1990 enzym cố định giải quyết được vấn đề  E. coli tái tổ hợp để sản xuất penicillin G acylase và Fusarium oxysporum tái tổ hợp sản xuất penicillin V acylase  7-ADCA: là tiền thân của 1/3 cephalosporin  7-ADCA được sản xuất từ penicillin G bằng phản ứng mở rộng vịng.  Merck và Panlabs: dùng P. chrysogenum mang gen cefE (expandase) của S. clavuligerus. Khi cung cấp disodium adipate, nĩ sản xuất adipoyl 6-APA, rồi được chuyển thành adipoyl 7-ADCA nhờ expandase tái tổ hợp. Mạch adipoyl được cắt nhờ adipoyl acylase của Pseudomonas thành 7-ADCA.  7-ACA: là tiền thân của 2/3 cephalosporin  được sản xuất từ cephalosporin C bằng phản ứng deacyl hĩa nhờ enzym hay hĩa học
  47. Các thế hệ Cephalosporin  I (cephalothin, cephaloridine, and cefazoline): biến đổi vị trí C-3 và C-7 của 7-ACA  II: kháng β-lactamase  Cephamycin C mang nhĩm 3-carbamoyl và 7-methoxy kháng β-lactamase: cefoxitin and moxalactam  7-oximinoacyl cephalosporin: cefuroxime  III: kháng β-lactamase + phổ rộng:  thêm nhĩm aminothiazole thân nước vào oximinocephalosporin (thế hệ II): cefotaxime, ceftizoxime, và ceftazidime  IV (cefepime và cefpirome): cĩ vịng aminothiazole ở C-7 cùng với nhĩm thế oxyimino và nitơ bậc IV ở C-3
  48. Sản xuất erythromycin  Chủng: Saccharopolyspora erythraea (Streptomyces erythreus )  Năng suất cao: 8-10 g/L  Ít sản phẩm phụ: > 90% Ery A 1 O Erythromycin R R A OH CH3 H C C H 3 3 B H CH3 C OH H R O H C H O H 3 C H H C H C 3 H N 3 3 O C H C H C H O 3 3 2 H O H O O 1 OR O C H H 3 C H O H H 3 H C 3 H O H C H 3
  49. Sản xuất acid amin
  50. Phương pháp sản xuất acid amin  Phương pháp trích ly các acid amin từ dịch thủy phân protein. Phương pháp này dùng để thu nhận L-cystein, L-cystin, L-leucin, L-asparagin, L-tyrosin  Phương pháp tổng hợp hĩa học. Phương pháp này dùng để sản xuất glycin, alanin, methionin, tryptophan  Phương pháp lên men vi sinh vật
  51. Phương pháp lên men vi sinh vật  Phương pháp sử dụng các chủng vi khuẩn hoang dại (L- glutamic acid, L-alanine, L-valine)  Phương pháp sử dụng vi khuẩn đột biến (L–lysine, L– threonine, L–arginine, L– citrulline, L–ornithine, L–homoserine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-histidine, )  Phương pháp thêm các tiền chất ( L-throenine, L-isoleucine, L- tryptophan )  Phương pháp enzym (L-aspartic acid, L-alanine, L-cyteine, L- dihydroxyphenylalanine, D-p-hydroxyphenyl-glycine )  Phương pháp sử dụng các dịng vi khuần được tạo ra bằng các kỹ thuật biến đổi gene, protein và chất chuyển hĩa hoặc sự kết hợp của các kỹ thuật trên (hydroxy-L-proline)
  52. L-Glutamic acid - điều kiện sản xuất  Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum  Mơi trường cĩ nồng độ đường và các ion aminonium cao, nồng độ khống chất thích hợp  Nồng độ biotin giới hạn hoặc bổ sung penicllin hoặc xà phịng  Điều kiện hiếu khí  Năng suất L-glutamate: khoảng 100 g/L /2-3 ngày
  53. L-Glutamic acid - điều kiện sản xuất  Chủng vi khuẩn: Corynebacterium , cần biotin  Nguồn carbon: glucose, thủy phân tinh bột  Nguồn nitơ: cao, ammoniac  Cơ chế: glutamate dehydrogenase amin hĩa 2-oxo- glutarate (Chu trình Krebs) thành glutamate  Vai trị biotin (hoặc penicillin, xà phịng): làm rị rỉ  Cơng nghệ gen:  Đột biến mất gen mã hĩa 2-oxoglutamate dehydrogenase sản xuất glutamate  Đột biến mất gen dtsR sản xuất glutamate
  54. L-Glutamic acid - ứng dụng  Monosodium L-glutamate: triệu tấn/năm  Làm bột ngọt, chất điều vị  Xà phịng, da nhân tạo  Phụ gia đơng khơ  Dược lý:  Chất dẫn truyền thần kinh  Glutamine: Điều hịa sự tăng trưởng và chức năng tế bào: cùng với hormon tăng trưởng để điều trị bệnh ruột ngắn (short bowel syndrome)  Rút ngắn thời gian hậu phẫu ruột  Acid amin khơng thiết yếu  Quá liều: nhức đầu, hội chứng “nhà hàng Trung Hoa”
  55. L-Lysine  Chủng vi khuẩn:Corynebacterium glutamicum,  Mơi trường cĩ nồng độ đường, ion ammonium cao, pH trung tính  Điều kiện hiếu khí Asp Asp-P ASA Hse Thr Leu DDP Met Ile DAP Lys Ức chế Ức chế ngược
  56. L-Lysine - Chủng  Đột biến tự dưỡng homoserine (hoặc threonine cộng với methionine), thiếu enzym homoserine dehydrogenase  Kiểu hình nhạy cảm với threonin hay methionin  Đột biến đề kháng chất tương tự lysine  Aspartokinase khơng nhạy cảm với ức chế ngược  Đột biến cần leucine  Cơng nghệ gen: tạo dịng và giải trình tự các gen liên quan  Gen ldc (mã hĩa lysine decarboxylase - phá hủy lysine)  Gen cadA (mã hĩa chất cảm ứng ldc)  Gen lysE (mã hĩa chất vận chuyển lysine ra khỏi tế bào)
  57. L-Lysine - Ứng dụng  Lysine được dùng làm chất bổ sung cho thức ăn gia cầm, heo vì các thức ăn thường dùng như ngũ cốc, đậu nành khơng béo chứa ít lysine, là một acid amin thiết yếu cho vật nuơi.  Lượng L-lysine được sản xuất trên thế giới hàng năm khoảng 400.000 tấn  Dược lý:  Acid amin thiết yếu  Dự phịng và điều trị Herpes simplex  Hỗ trợ điều trị ung thư (đang nghiên cứu)
  58. L-Threonine  Chủng:  đột biến dị dưỡng L-lysin, diaminopimelate, hay L- methionin  và/hay đột biến đề kháng chất tương tự threonin  các chủng được tạo ra bằng cơng nghệ gen Asp Asp-P ASA Hse Thr Leu DDP Met Ile DAP Lys Ức chế Ức chế ngược
  59. L-Threonin - Cơng nghệ gen  S. marcescen đột biến bằng giới nạp với phage  khiếm khuyết enzym thối hĩa L-threonin  đột biến trên aspartokinase và homoserine dehydrogenase làm mất nhạy cảm với quá trình ức chế ngược của L-threonin  đột biến ở các enzym sinh tổng hợp L-threonin làm cho chúng khơng bị ức chế bởi L-threonin  đột biến trên aspartokinase làm mất nhạy cảm với sự ức chế ngược bởi L-lysin  đột biến ở aspartokinase và homoserine dehydrogenase làm cho chúng khơng bị ức chế bởi L- methionine
  60. Sản lượng L-threonin của các chủng vi khuẩn đột biến Thời gian Lượng Tốc độ Giống Tác giả (h) (g/l) (g/l/h) C. glutamicum 90 52 0.58 Katsumata B. lactofermentum 100 58 0.58 Ishida S. marcescen 96 100 1.04 Masuda E. coli 72 65 0.90 Shimizu E. coli 77 100 1.30 Okamoto
  61. L-Threonin - ứng dụng  acid amin thiết yếu cho con người và vật nuơi như heo, gia cầm.  Nĩ được dùng làm chất bổ sung cho thức ăn động vật, dược phẩm, thức ăn, mỹ phẩm.  Trên thế giới, mỗi năm sản xuất khoảng 13.000- 14.000 tấn
  62. L-Aspartic Acid  Sản xuất bằng cơng nghệ enzym 1 hoặc 2 giai đoạn  Nguyên liệu đầu là fumarate (1 giai đoạn) hoặc maleate (2 giai đoạn)  Enzym aspartase được cố định trên nhựa trao đổi ion  E. coli sinh aspartase được cố định trong polyacrylamid hay K-carageenan  E. coli sinh aspartase được cố định trong polyurethane và polyazetidine  Cơng nghệ gen: chủng coryneform cĩ hoạt tính maleate isomerase và aspartase, nồi phản ứng màng
  63. L-Aspartic Acid Maleate isomerase Aspartase Maleate Fumarate L-aspartate Maleaic acid Fumaric acid
  64. L-Aspartic Acid - ứng dụng  dịch truyền dinh dưỡng, phụ gia thực phẩm,  nguyên liệu sản xuất aspartame, aspartyl- phenylalanine methyl ester.  sản xuất polymer cĩ thể phân hủy sinh học.  dùng như xà phịng, tác nhân chelat hĩa hay xử lý nước
  65. L-Alanine  Cơng nghệ enzym với aspartate β-decarboxylase  Pseudomonas dacunhae cố định trên polyacrilamide, κ- carageenan, nhồi cột Aspartate β-decarboxylase L-aspartate L-alanine + CO2 aspartase Aspartate β-decarboxylase Fumarate + NH3 L-aspartate L-alanine + CO2 malate D-alanine
  66. Thực phẩm chức năng
  67. Một số định nghĩa  Thực phẩm chức năng (functional food)  Thực phẩm tăng cường (fortified food)  Dược thực phẩm (nutraceutical)  Tinh chất thực vật (phytochemical)  Dược mỹ phẩm (cosmeceutical)  Chất trợ sinh (probiotic)  Chất tiền sinh (prebiotic) Thực phẩm Thực phẩm Chức năng Dược phẩm
  68. Prebiotic - yêu cầu  Khơng được thủy phân hay hấp thu ở đoạn trên của ống tiêu hĩa  Là cơ chất chọn lọc của một hay một số giới hạn vi khuẩn cĩ lợi sống hội sinh trong ruột già, do đĩ các vi khuẩn này sẽ được kích thích tăng trưởng hay chuyển hĩa  Cĩ khả năng thay đổi thành phần hệ vi khuẩn ruột già theo hướng cĩ lợi  Tạo ra các hiệu ứng cĩ lợi tại chổ hay tồn thân đối với người sử dụng.  carbohydrate khơng tiêu hĩa được: các oligo fructose, glucose, xylose và galactose
  69. Prebiotic - chức năng  kiểm sốt thời gian lưu chuyển thức ăn qua ruột  cải thiện hấp thu glucose,  giảm hấp thu chất béo và cholesterol,  tăng thể tích và khả năng giữ nước của thức ăn trong ruột non,  điều hịa sự lên men vi sinh vật để làm tăng sản xuất các acid béo chuỗi ngắn,  giảm pH và ammoniac.  giảm các rối loạn đường ruột (táo bĩn và tiêu chảy),  bệnh tim mạch, và ung thu ruột
  70. Probiotic - các yêu cầu chung  Chủng vi sinh vật phải cĩ những đặc điểm phù hợp với cơng nghệ để cĩ thể đưa vào sản xuất.  Cĩ khả năng sống và khơng bị biến đổi chức năng khi đưa vào vào sản phẩm.  Khơng gây các mùi vị khĩ chịu cho sản phẩm.  Cĩ khả năng sống sĩt khi đi qua đường tiêu hĩa (dạ dày-ruột non) nếu được sử dụng qua đường này.  Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng.  Cĩ khả năng thực hiện chức năng trong mơi trường nơi chúng được định hướng.
  71. Probiotic - yêu cầu an tồn  Cĩ định danh chính xác  Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là cĩ nguồn gốc từ người.  Được phân lập từ đường tiêu hĩa của người khỏe mạnh.  Được chứng minh là khơng cĩ khả năng gây bệnh.  Khơng liên quan tới bệnh tật, ví dụ như nhiễm trùng nội mạc cơ tim, hay gây rối loạn tiêu hĩa.  Khơng gây khử liên hợp muối mật.  Đặc điểm di truyền ổn định.  Khơng mang các gen đề kháng kháng sinh cĩ thể truyền được.
  72. Probiotic - yêu cầu chức năng  Cĩ khả năng dung nạp với acid và dịch vị của người.  Cĩ khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để probiotic cĩ thể sống sĩt được khi đi qua ruột non).  Cĩ khả năng bám dính vào bề mặt niêm mạc ruột và tồn tại lâu dài trong đường tiêu hĩa.  Cĩ khả năng kích thích miễn dịch nhưng khơng cĩ tác động gây viêm.  Cĩ khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên.  Sản xuất các chất kháng sinh vi sinh vật (ví dụ bacteriocin, hydrogen peroxide, acid hữu cơ)  Cĩ hoạt tính đối kháng với tác nhân gây bệnh như Helicobacter pylori, Samonella sp., Listeria monocytogenes và Clostridium difficile.  Cĩ khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư.  Các lợi ích khác được chứng minh trên lâm sàng.
  73. Probiotic - yêu cầu cơng nghệ  Cĩ những đặc tính tốt về cảm quan.  Đề kháng với thực khuẩn.  Dễ sản xuất: tăng trưởng đủ mạnh, dễ thu hoạch.  Cĩ khả năng sống sĩt trong quá trình sản xuất.  Ổn định trong quá trình sản xuất và bảo quản.  Cĩ thể đánh giá chất lượng khi được trộn vào sản phẩm cuối cùng.
  74. Probiotic - ứng dụng  Cho người:  Phịng bệnh, tình trạng sức khỏe  Điều trị một số rối loạn hệ vi sinh vật  Điều trị: bệnh Crohn, tiêu chảy trẻ em, viêm ruột, tiêu chảy do Clostridium  Thú y và Thủy sản:  Biện pháp hạn chế sử dụng kháng sinh  Giúp tăng trọng  Phịng bệnh
  75. Probiotic - một số lưu ý  Tính chất của một sản phẩm probiotic là một thuộc tính của chủng được sử dụng khơng phải là của lồi được sử dụng  Các tính chất phải được chứng minh bằng thử nghiệm in vitro, in vivo hay lâm sàng
  76. Cơng nghệ enzym
  77. Khái niệm xúc tác sinh học  Enzym là chất xúc tác của các quá trình sinh học,  Bản chất là protein  Giúp phản ứng đạt được điểm cân bằng nhanh hơn  Enzym khơng thể xúc tác phản ứng với sự thay đổi năng lượng tự do khơng thuận lợi trừ khi phản ứng đĩ cĩ thể song hành với một phản ứng khác cĩ sự thay đổi năng lượng tự do thuận lợi hơn  Giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn trong điều kiện bình thường về áp suất, nhiệt độ, pH
  78. Cơng nghệ enzym hiện đại  Hĩa học protein  Lý sinh phân tử  Sinh học phân tử  Cấu trúc, hoạt động của protein-enzym  Can thiệp để thay đổi phân tử protein-enzym
  79. Nhu cầu sử dụng enzym Chỉ tiêu Cơng nghiệp Phân tích Dược phẩm Lượng sử Tấn Milligam gam Milligam gam dụng Độ tinh Khơng tinh Tinh thể tinh Tinh thể tinh khiết khiết khiết khiết Nguồn Vi sinh vật, Vi sinh vật, động Vi sinh vật, động gốc thường ngoại vật, thực vật, vật, thực vật, bào thường nội bào thường nội bào Giá sản Thấp Trung bình Cao xuất
  80. Xúc tác sinh học  Tính chọn lọc cao  Chọn lọc theo vị trí nhĩm hĩa học  Chọn lọc khơng gian  Hoạt động trên cơ chất đa dạng  Hoạt động được trong mơi trường khơng phải là nước  Khả năng đảm nhận lượng cơ chất cao  Cĩ độ bền đủ cao  Tính kinh tế
  81. Tính chọn lọc theo vị trí CH CH O 3 O 3 N N N N CH3 N N NH vinyl acetat O 5' N N NH HO O 2 O O 2 C. antarctica lipase HO OH HO OH Dẫn xuất Purine (Nelarabine) Sản phẩm acyl hĩa
  82. Tính chọn lọc khơng gian (S)-naproxen COOH H3CO COOCH3 lipase + H2O COOCH H3CO 3 (R,S)-naproxen methyl ester H3CO (R)-naproxen methyl ester
  83. Nguồn cung cấp enzym  Chiết tách  Động vật  Thực vật  Lên men  Vi sinh vật  Nuơi cấy tế bào  Cơng nghệ gen
  84. Sản xuất enzym  Chuẩn bị nguyên liệu sinh học  Chiết tách enzym ra khỏi mơ hay tế bào  Cơ đặc dịch enzym thơ  Tinh chế đạt độ tinh khiết mong muốn
  85. Chuẩn bị nguyên liệu sinh học  Cơ quan động vật  Loại chất béo và mơ liên kết trước khi đơng lạnh  Bảo quản lạnh đến khi đủ mẫu để xử lý  Nghiền trên máy nghiền thịt và enzym được chiết với dung dịch đệm.  Enzym để phá vỡ tế bào  Nguyên liệu thực vật  Thực vật cĩ thể được nghiền và chiết với dung dịch đệm.  Tế bào cũng cĩ thể được phá vỡ bằng cách xử lý với enzym.  Vi sinh vật  Ngoại bào: tách tế bào ra khỏi dung dịch lên men.  Nội bào: phá vỡ tế bào
  86. Các phương pháp phá vỡ tế bào Phương pháp cơ học Phương pháp khác Áp suất cao (Manton - Gaulin, Làm khơ (đơng khơ, dung French-press) mơi hữu cơ) Nghiền (máy nghiền bi) Ly giải: Nghiền (máy nghiền bi) Vật lý: đơng lạnh, sốc thẩm thấu Hĩa học: chất tẩy, kháng sinh Enzym: lysozyme, kháng sinh
  87. French-press
  88. Chiết tách  Ly tâm  Lọc  Cross-flow  Tủa bơng
  89. Cơ đặc  Bay hơi  Kết tủa  Muối  Dung mơi hữu cơ  Polymer  Siêu lọc
  90. Tinh chế  Kết tinh  Điện di  Sắc ký Loại sắc ký Nguyên lý Tách theo Hấp phụ Liên kết bề mặt Ái lực bề mặt Phân bố Cân bằng phân bố Tính phân cực Trao đổi ion Liên kết ion Điện tích Lọc gel Khuếch tán lỗ Kích thước và hình dạng phân tử Ái lực Hấp phụ đặc hiệu Cấu trúc phân tử Kỵ nước Tương tác kỵ nước Cấu trúc phân tử Đồng hĩa trị Liên kết đồng hĩa trị Tính phân cực Đánh bắt ion kim Sự thành lập phức Cấu trúc phân tử loại
  91. Enzym cố định  Ưu điểm  Enzym cĩ thể được sử dụng lặp lại nhiều lần  Chế phẩm bền hơn enzym tự do  Enzym cố định cĩ tốc độ phản ứng lớn, dễ tổ chức sản xuất ở mức độ tự động hĩa cao.  Nhờ sự cố định mà enzym khơng lẫn vào sản phẩm cuối  Enzym cố định bảo quản tốt hơn enzym tự do cùng loại  Nhược điểm  Giảm hoạt tính của enzym so với ban đầu.  Cản trở về khơng gian do liên kết với chất mang làm hạn chế sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất.
  92. Vật liệu cố định  Chất mang phải rẻ tiền, dễ tìm hoặc dễ tổng hợp  Chất mang phải cĩ tính cơ lý ổn định  Chất mang phải bền vững về mặt hĩa học, khơng hịa tan trong mơi trường phản ứng.  Chất mang phải cĩ diện tích bề mặt lớn  Cĩ khả năng trương nở trong mơi trường
  93. Các phương pháp cố định enzym Phương pháp liên kết với chất mang Phương pháp khác Đặc tính Hấp phụ Liên kết Liên kết Liên kết Bắt giữ vật lý ion đồng hĩa trị chéo Kỹ thuật Dễ Dễ Khĩ Khĩ Khĩ Hoạt tính enzym Thấp Cao Cao Trung bình Cao Tính đặc hiệu cơ Khơng đổi Khơng đổi Thay đổi Thay đổi Khơng đổi chất Lực liên kết Yếu Trung bình Mạnh Mạnh Mạnh Khả năng tái cố Cĩ thể Cĩ thể Khơng Khơng Khơng định Khả năng ứng dụng Thấp Trung bình Trung bình Thấp Cao Chi phí cố định Thấp Thấp Cao Trung bình Thấp
  94. Cố định thuận nghịch E Me- E E Liên kết ion kim Hấp phụ Me- E loại hoặc chelate E Me- E + - E S S E + - E Liên kết ion Liên kết disulfit S S E + - E S S E E E Liên kết ái lực E
  95. Cố định khơng thuận nghịch E E E Liên kết đồng hĩa trị E E Tạo vi hạt bao E E E E E E E E E E Bắt giữ Liên kết chéo E E E E E E
  96. Ứng dụng enzym trong ngành dược  Liệu pháp enzym  Enzym trong sản xuất thuốc
  97. Liệu pháp enzym  Thay thế các enzym bị mất hay kém chức năng do bệnh di truyền;  Thay thế enzym bị mất hay kém chức năng do một bệnh mắc phải ở các cơ quan chịu trách nhiệm tổng hợp chúng;  Cung cấp một tác dụng sinh học đặc hiệu do đặc tính xúc tác của enzym
  98. Liệu pháp enzym  Phải đến được vị trí tác động của chúng trong cơ thể hay mơ.  Phải cĩ hoạt tính trong các điều kiện mơi trường tại nơi tác động.  Chúng phải đủ bền để cĩ được các thơng số dược động học cần thiết,  Độ tan thỏa mãn yêu cầu nếu được dùng theo đường tiêm bắp hay dưới da.  Độ tinh khiết đủ cao  Cĩ hiệu quả điều trị dựa trên hoạt tính đặc hiệu của enzym được dùng. Hiệu quả của liệu pháp phải được chứng minh  An tồn đối với bệnh và chỉ định điều trị  Dạng sử dụng thuận tiện
  99. Các vấn đề của thuốc protein  Khơng ổn định  Sinh khả dụng  Tính thấm tế bào  Tính chất gây miễn dịch  Phản ứng dị ứng  Sản xuất và kiểm định  Lợi thế  Ít tác dụng phụ hơn  Thời gian phát triển ngắn
  100. Sản xuất thuốc bằng cơng nghệ enzym
  101. Thuốc đối quang  Cấu trúc khơng gian của phân tử sinh học và thụ thể  Chỉ một trong hai đồng phân cĩ hoạt tính,  Các đồng phân cĩ hoạt tính khác nhau  Dược động học và chuyển hĩa khác nhau  Thuốc tinh khiết quang học (enantiopure  Bản quyền đồng phân
  102. Thuốc đối quang Tác dụng dược lý chính Khác biệt giữa các đồng phân Thuốc chẹn β: l > d (d = khơng cĩ hoạt tính) propranolol, acebutolol, atenolol, alprenolol, Ví dụ: S(-)-propranolol > R(+)-propranolol betaxolol, carvedilol, metoprolol, labetalol, pindolol, sotalol, Thuốc chẹn kênh calci: l > d verapamil, nicardipine, nimodipine, nisoldipine, Ví dụ: S(-)-verapamil > R(+)-verapamil felodipine, mandipine Thuốc giãn phế quản: l > d (d = khơng cĩ hoạt tính) albuterol (salbutamol), salmeterol và terbutaline Ví dụ: R(-)-albuterol > S(+)- albuterol An thần: l > d hexobarbital, secobarbital, mephobarbital, Ví dụ: S(-)-secobarbital > R-(+)secobarbital pentobarbital, thiopental, thiohexital Thuốc gây mê: d > l (l = khơng cĩ hoạt tính) ketamine, isoflurane Ví dụ: S(+)-ketamine > R(-)-ketamine S(+)-isoflurane > R(-)-isoflurane Giảm đau tác động trung ương: Methadone Ví dụ: R(-)-methadone > S(+)-methadone Kháng viêm khơng steroid: d > l ibuprofen, ketoprofen, benoxaprophen, fenprofen Ví dụ: S(+)-ibuprofen > R(-)-ibuprofen An thần: nhĩm 3-hydroxy-benzodiazepines: d > l (l = khơng cĩ hoạt tính) oxazepam, lorazepam, temazepam Ví dụ: S(+)-oxazepam > R(-)- oxazepam
  103. Thuốc đối quang - racemic Khơng bất đối: 2 Tự nhiên/ Chế phẩm dạng bán tổng hợp: 147 racemic: 8 Bất đối: 145 Chế phẩm một đồng phân: 119 Thuốc: 668 Chế phẩm một đồng phân: 110 Bất đối: 252 Chế phẩm dạng Tổng hợp: 521 racemic: 140 Khơng bất đối: 269
  104. Các loại phản ứng được xúc tác bởi enzym Lớp enzym theo IUBMB Phản ứng xúc tác EC 1 Oxidoreductases Oxi hĩa/khử đối với –CH–OH, –C=O, –C=C, Khơng địi hỏi đồng cơ chất EC 2 Transferases Chuyển các nhĩm chức như halogen, aldehyde, keto, acyl, Khơng địi hỏi đồng yếu tố glycosyl, EC 3 Hydrolases Thủy phân/ngưng tụ các ester, glycosid, nitril, amid, Khơng địi hỏi đồng yếu tố halogen, EC 4 Lyases Thêm/loại bỏ; cắt các liên kết C–C, C–O, C–N Khơng địi hỏi đồng yếu tố EC 5 Isomerases Đồng phân hĩa, chuyển dạng cis-trans, epime hĩa Khơng địi hỏi đồng yếu tố EC 6 Ligases Tạo các liên kết C–O, C–S, C–N, C–C Cần đồng cơ chất ATP
  105. Một số vấn đề cơng nghệ  Chi phí cố định phải bù đắp được bởi sự gia tăng tính ổn định hoặc hoạt tính.  Giảm thiểu sự mất hoạt tính trong quá trình cố định.  Khi enzym được cố định bằng phương pháp cĩ tính thuận nghịch, sự rị rỉ enzym phải được nghiên cứu và cĩ biện pháp thích hợp.  Sự giới hạn về luân chuyển vật chất trong chất mang cần được tính tốn khi điều chỉnh pH hay nhiệt độ trong quá trình phản ứng.  Với enzym tự do, hoạt tính chuyển hĩa cĩ thể đạt được cao hơn ở nồng độ enzym cao, do đĩ việc chuyển hĩa các cơ chất khĩ cĩ thể thực hiện được.  Tính vơ trùng của phản ứng cần được quan tâm.  Sự tương thích của dung mơi với chất mang và ảnh hưởng của dung mơi đến hoạt tính cần được xem xét.
  106. Lựa chọn nồi phản ứng * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * a * * * * * b c * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * d e f A: vận hành theo lơ; B: vận hành theo lơ cĩ tuần hồn; C: thùng khuấy cĩ siêu lọc; D: thùng khuấy vận hành liên tục; E: thùng nhồi liên tục; F: tầng sơi liên tục
  107. Động học phản ứng Kiểu nồi phản ứng Nồng độ theo thời gian Nồng độ theo vị trí [S]0 [S]0 t0 A [P] ộ ộ [S]1 t1 ng đ ng ng đ ồ ồ N N [S] e t [S] e Thời gian Vị trí B [S]0 [S]0 x0 [S] [S] 0 e [P] ộ [S]1 ộ x1 ng đ ng đ ng dx ồ ồ N N Vị trí [S]e 0 e xe [S] Thời gian Vị trí C [S]0 [S] [S]0 [S]0 [P] ộ [P] ộ [P] ng đ ng đ ng ồ ồ N N [S] [S] Thời gian Vị trí
  108. Oxidoreductase Ph Ph HN HN N N Ph N N Ph Nucleoside Oxidase O 5' N N Cl o N N Cl HO O H2O, pH 6, 25 C, 12-24h HO O HO OH HO OH .Nucleoside oxidase lấy từ Stenotrophomonas maltophilia (FERM BP-2252) .Sản xuất các dẫn xuất 5’-carboxylic acid của các nucleoside đồng đẳng. .Enzym thơ từ dịch chiết tế bào .Hoặc enzym cố định trên Eupergit-C
  109. Lipase F F F OH OAc OH Lipase + 37oC, 20h O O O O O O F N N F N N F N N N N N N (S)-acetat N N (R) racemic Lipase F F H2O OH OH COOH OH O O F N N F N N N N N N (S) Thuốc hạ cholesterol
  110. Lipase O O O O OH Lipase o + H2O, 25 C, 4h O O O O O O (3R,4S)-phenol racemic cis-hexanoate N O O (-)-Ormeloxifene Thuốc ngừa thai tác dụng kéo dài (1 viên/tuần) O
  111. Lipase F F F F Lipase pH 7, MeCN + O CO2Et 45oC, 24h CO2H CO2Et O O O N O N O N N H H H H Paroxetine Thuốc chống trầm cảm
  112. Lipase CH3 O OH CH3 O (S)-(+)-ibuprofen Novozym 435 OH + CH O 1-Dodecanol 3 OC12H25 (R,S)-ibuprofen (R)-(-)-ibuprofen ester Thuốc kháng viêm khơng steroid
  113. Amidase O O O- O + NH NH NH3 -lactamase + o H2O, 70 C rac-lactam (+)-lactam (-)-acid amin OH N NH Đồng đẳng Carbovir HO N N NH2 Thuốc kháng HIV Carbovir
  114. Deaminase NH2 O NH2 N Cytidine Deaminase NH N + H O, pH 7, 32oC, 35-70h N O 2 N O N O O O O HO HO HO S S S Lamivudine Thuốc kháng virus (HBV, HIV)
  115. Lyase CN Tế bào R. rhodochrous J1 CONH2 cố định o N H2O, pH 8, 25 C, 18h N Nicotinamide Vitamin B3