Bài giảng Cấu trúc sinh học phân tử của HBV ý nghĩa trong lâm sàng - Đặng Thị Nga

Nội dung text: Bài giảng Cấu trúc sinh học phân tử của HBV ý nghĩa trong lâm sàng - Đặng Thị Nga

1. CCẤẤUU TRTRÚÚCC SINHSINH HHỌỌCC PHÂNPHÂN TTỬỬ CCỦỦAA HBVHBV ÝÝ NGHNGHĨĨAA TRONGTRONG LÂMLÂM SSÀÀNGNG ĐĐẶẶNGNG THTHỊỊ NGANGA
2. DDỊỊCHCH TTỂỂ
3. LLỊỊCHCH SSỬỬ VVỀỀ BBỆỆNHNH VIÊMVIÊM GANGAN DODO VIRUSVIRUS BB Hippocrate (thế kỷ thứ V trước công nguyên) 1898 được gọi là bệnh Botkin 1963 Bruch Blumberg đã tìm thấy một loại KT trong máu của bệnh nhân bị haemophili đã được truyền máu nhiều lần. KT này phản ứng lại với KN trong mẫu huyết thanh của một thổ dân châu Úc (được gọi là KN Au - Australia antigen). Sau đó KN này được tìm thấy trong huyết thanh bệnh nhân bị VGSV . Ngày nay KN Au được xác định chính là KN bề măt của VGSV B, viết tắt là HBsAg Năm 1970 Dane, J.Cameron và cộng sự đã phân lập được HBV hoàn chỉnh gọi là tiểu thể Dane, và từ đây người ta phát hiện nhiều dấu ấn khác của HBV như HBeAg, anti-HBe, HBcAg, anti-HBc
4. HBVHBV HBV thuộc họ Hepadaviridae, là một loại virus hướng gan có cấu trúc DNA. Đây là một loại virus gây bệnh cho người và một số loài linh trưởng khác Trong huyết thanh bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân đôi của virus, người ta tìm thấy 3 hình dạng khác nhau của virus - Tiểu thể Dane (còn gọi là virion hoàn chỉnh) - Cấu trúc hình cầu - Cấu trúc hình ống
5. CCẤẤUU TRTRÚÚCC BBỘỘ GENGEN CCỦỦAA HBVHBV HBV cá một phần vỏ với 3 loại protein S,M,L (KN HBsAg) Một phần nhân với - Màng bọc protein gọi là capside - Sợi đôi DNA Phần nhân và màng bọc này gọi là nucleocapsid (đủ thành phần để cấu tạo một virion) Cả phần vỏ và phần nucleocapside tạo ra một virion thực sự
6. CCẤẤUU TRTRÚÚCC BBỘỘ GENGEN CCỦỦAA HBVHBV Bộ gen của HBV được cấu tạo từ một phân tử DNA vòng, có khoảng 3200 nucleotide (3,2 kb). DNA này bao gồm hai chuỗi, có chiều dài khác nhau: * Chuỗi dài nằm ngoài, (kí hiệu là L) có tính cực âm (-), tạo nên một vòng liên tục có chiều dài cố định 3200 nucleotide và gần như khép kín (3,2 kb) mã hoá cho các thông tin di truyền của siêu vi. * Chuỗi ngắn nằm trong, (kí hiệu là S) có tính cực dương (+), chiều dài thay đổi từ 50- 100% chiều dài của bộ gen.
7. CCẤẤUU TRTRÚÚCC BBỘỘ GENGEN CCỦỦAA HBVHBV Đặc điểm DNA của HBV là ở chổ không phải xoắn 2 vòng như các DNA của các virus khác mà chỉ xoắn một đoạn cuối và xếp thành hình tròn DNA của HBV không sao chép thẳng thành một DNA của virus mới khi vào trong tế bào gan, mà lại sao chép qua bước tạo ra 2 sợi mRNA nhờ RNA của tế bào kí chủ 2 sợi mRNA này được gọi là tiền genome, chứa đựng toàn bộ thông tin di truyền của virus. Từ 2 sợi mRNA này sẽ tổng hợp các thành phần của virion, và lúc này thì virion lại có DNA polymerase để sao chép từ mRNA ra DNA của hệ gen (tiến trình sao chép ngược). Như vậy DNA polymerase tác dụng như một men sao chép ngược Khi sợi DNA dài đã hình thành thì sợi mRNA cũng tự phá hủy. Quá trình nhân đôi của sợi DNA được bắt đầu tại trình tự DR2 của sợi đầu và được tiếp tục nhờ sự khép vòng của sợi DNA. Sợi ngắn DNA có độ dài khác nhau do hoạt động của DNA polymerase, vì khi phần capside được bao bọc sẽ làm gián đoạn hoạt động của DNA polymerase
8. CCẤẤUU TRTRÚÚCC BBỘỘ GENGEN CCỦỦAA HBVHBV Quy luật kinh điển là một gen-một protein, nhưng ở đây số lượng nucleoside của HBV rất ít, chỉ 3200, vì vậy các đoạn gen gối chồng lên nhau ; người ta đã xác định có 4 đoạn gen kí hiệu là S, C, P, X.
9. TTỔỔ CHCHỨỨCC BBỘỘ GENGEN HBVHBV Chỉ có sợi DNA (-) mới được mã hoá. Trên sợi DNA này có 4 đoạn gen tương ứng với 4 khung dọc mở (opening reading frame) là các vùng mã hoá để tổng hợp các protein của siêu vi như protein bề mặt, protein của lõi, polymerase và protein X, qua trung gian của các mRNA; có nhiều dài thay đổi lần lượt là 2,1kb; 2,4kb; 3,5kb và 0,5 kb.
10. TTỔỔ CHCHỨỨCC BBỘỘ GENGEN HBVHBV Gen pre-S1, pre-S2 và S: tổng hợp protein của KN bề mặt (HBsAg). Gen pre-C và C: tổng hợp protein của KN lõi (HBcAg và HBeAg) Gen X: tổng hợp Protein có tác dụng chuyển hoạt hoá (transactivation). Gen P tổng hợp Polymerase
11. GenGen SS Bao gồm vùng S, Pre-S1 và Pre-S2 mã hóa để tổng hợp các protein bề mặt hay HBsAg. Vùng S và Pre-S2 có chiều dài cố định trong khi đó vùng Pre-S1 có chiều dài thay đổi tùy theo từng phân typ khác nhau Gen S
12. GenGen SS Gen S tổng hợp nên protein S (Small) có chiều dài 24kd gồm 226 acid amin. Protein này gồm hai thành phần này là p24 và Gp27 (Glycoprotein) đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số Đoạn S và Pre-S2 tổng hợp protein M (Medium) có chiều dài 33 kd gồm281 acid amin. Protein này gồm hai loại Glycoprotein là Gp33 và Gp 36. Vùng Pre-S2 có vai trò giúp cho siêu vi bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ nó liên kết với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh người, đồng thời trên tế bào gan cũng có các thụ thể gắp với albumin trùng hợp trong huyết thanh người pHSA (Polymerized Human Serum Albumin ). Nếu trên tế bào gan thiếu các thụ thể này thì có thể làm cho tế bào gan có khả năng đề kháng với sự nhiễm HBV. Gen S, Pre-S1 và Pre_S2 tổng hợp protein L (Large) có chiều dài 39 kd gồm 2 loại p39 và Gp42. Chuỗi protein Pre-S1 có chiều dài thay đổi tùy theo từng phân typ khác nhau; đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt của tế bào gan sẽ liên kết với siêu vi, giúp siêu vi xâm nhập vào trong tế bào.
13. ProteinProtein bbềề mmặặtt hayhay HBsAgHBsAg Cả 3 loại protein này hiện diện với số lượng khác nhau trên bề mặt của virion, trong đó Protein S chiếm đa số. Protein M chiếm 5 đến 10% và Protein L chiếm 20% trong vỏ bọc của virion
14. ProteinProtein bbềề mmặặtt hayhay HBsAgHBsAg Nguời ta phát hiện vùng S có ít nhất 5 quyết định khàng nguyên của HBsAg. Tùy theo sự phân bố của các HBsAg quyết định kháng nguyên này mà a người ta phân biệt ra các phân typ khác nhau. ad ay Mỗi phân typ đều có chung phần quyết định kháng nguyên a và khác adw adr ayw ayr nhau tùy theo sự ghép cặp của các quyết định kháng nguyên d hoặc y ghép với w hoặc r để tạo nên các a1-2dw a3dw a1yw a2-1yw a2-3yw a3yw phân typ như adw, ayw, adr, ayr. Chính vùng a có liên quan đến tính miễn dịch vì nó quyết định cho sự tổng hợp Anti HBs
15. ProteinProtein bbềề mmặặtt hayhay HBsAgHBsAg HBsAg in Cytoplasm of HBsAg Ground Glass Hepatocytes
16. GENGEN CC Gen C gồm vùng C và pre-C Nếu quá trình đọc mã thực hiện suốt chiều dài của đoạn pre-C và C sẽ tổng hợp được HBeAg. Các nucleotide đầu tiên của vùng pre-C sẽ mã hóa cho việc tạo nên một đoạn peptide tín hiệu. Đoạn peptide tín hiệu này giúp cho HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, đồng thời cũng giúp cho kháng nguyên này hòa tan được trong huyết thanh. Vì vậy HBeAg được gọi là KN hòa tan. KN này không tham gia vào cấu trúc của virion và chức năng của nó chưa được biết rõ. Sự hiện diện của HBeAg phản ảnh tình trạng nhân đôi của siêu vi và có liên quan đến tính lây nhiễm Nếu quá trình đọc mã chỉ đi suốt đoạn C thì sẽ tổng hợp nên KN lõi hay còn gọi là HBcAg. HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu nên nó không được bài tiết ra khỏi tế bào gan, do đó không thể tìm thấy trong huyết thanh bệnh nhân
17. HBcAgHBcAg HBcAg in Nuclei and Cytoplasm HBcAg
18. GENGEN PP Gen P chiếm 80% chiều dài của bộ gen Sản phẩm của gen P là một men vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc RNA, vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNA DNA polymerase được dùng để tổng hợp một DNA mới từ RNA tiền genome (sợi RNA này được tạo ra từ khuôn mẫu DNA của HBV dưới tác dụng của RNA polymerase của tế bào gan) Như vậy sản phẩm của gen P liên quan đến cơ chế sao chép ngược của virus, và tham gia một phần vào việc tạo ra capside bao bọc bên ngoài cấu trúc của tiền genome
19. CCấấuu trtrúúcc vvàà chchứứcc nnăăngng ccủủaa PolymerasePolymerase Gen P mã hóa để tổng hợp polymerase của virus. Men này có đặc tính tương tự như các men sao chép ngược khác. Cấu trúc của polymerase bao gồm: Ở đầu N-tận của polymerase của virus có một acid amin là Tyrosin tương đối hằng định, được sử dụng làm chất mồi (primase) để khởi phát quá trình tổng hợp DNA của virus Tiếp theo là vùng “khoảng trống” (Spacer) có trình tự rất thay đổi, nó giúp cho men này không thay đổi chức năng khi có đột biến xãy ra. Kế đến là vùng có hoạt tính của men sao chép ngược, bao gồm một trình tự các a.amin tương đối hằng định đó là Tyrosin-Methionin- Asparagin-Asparagin. Trình tự này có lẽ là vị trí xúc tác của men sao chép ngược Ở đầu C-tận là vùng của men Ribonuclease H (RNase H), có chức năng làm thoái biến khuông RNA trong lúc tổng hợp sợi DNA(-)
20. GENGEN XX Chức năng của gen này vẫn chưa được biết chính xác, nhưng có lẽ nó đóng vai trò chuyển hoạt hóa (transactivation) trong quá trình nhân đôi của virus. Sự chuyển hoạt hóa như vậy có thể làm tăng sự nhân lên của HBV và cả những virus ngoài HBV như HIV Protein X còn có liên quan đến sự điều hòa quá trình tăng trưởng của tế bào, cho nên có vai trò trong cơ chế sinh ung thư của tế bào gan bị nhiễm
21. SSỰỰ ĐĐỘỘTT BIBIẾẾNN GENGEN CCỦỦAA HBVHBV Kỹ thuật PCR giúp cho các nhà khoa học phát hiện các biến đổi trên trình tự chuỗi DNA của bộ gen HBV Sự đột biến gen của HBV có lẽ là hậu quả của 2 yếu tố Tốc độ nhân đôi của HBV khá nhanh Khả năng đọc và sữa chữa trong quá trình nhân đôi của bộ gen không hoàn chỉnh: virus sử dụng DNA polymerase trong suốt quá trình nhân đôi nhưng men này lại thiếu chức năng sữa chữa trong khi sao chép
22. BiBiếếnn chchủủngng PrePre CC Đoạn gen pre-C và C sẽ tổng hợp nên HBeAg Một số trường hợp xãy ra đột biến ở vùng pre-C tại vị trí nucleotide 1896, Guanosin được thay thế bằng Adenin tạo nên một trình tự TAG (thay thế TGG). TAG là một codon kết thúc. Chính codon kết thúc này chấm dứt việc giải mã vùng pre-C, cho nên sự tổng hợp HBeAg không được thực hiện mặc dù quá trình nhân đôi của HBV vẫn tiếp diễn ( HBV DNA (+), AND polymerase (+) ), và sự tổng hợp HBcAg vẫn không ảnh hưởng nên vẫn tạo được phần lõi. HBeAg và HBcAg có chung vùng “quyết định miễn dịch” chính, cho nên antiHBe vẫn được thành lập mặc dù không có sự hiện diện của HBeAg. Đột biến này có liên quan đến điều trị bằng interferon
23. BiBiếếnn chchủủngng PrePre CC Việc tồn tại kéo dài của HBV biến chủng pre-C trong máu bệnh nhân thường làm tăng men gan và các biến chứng khác như xơ gan, Kgan, hoặc nguy cơ viêm gan bùng phát (cơ chế có lẽ do đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh của kí chủ đối với HBV nhằm thải trừ HBV thông qua sự phá hủy tế bào gan bị nhiễm ồ ạt)
24. BiBiếếnn chchủủngng trêntrên vvùùngng HBsAgHBsAg Biến chủng này có liên quan đến những trẻ em được sinh ra từ những bà mẹ mang HBV.Nghiên cứu trên 345 trẻ của các bà mẹ có HBsAg(+) và HBeAg(+), mặc dù sau khi sinh ra những đứa trẻ này đươc chích miễn dịch thụ động và chủng ngừa vaccin viêm gan B đầy đủ 3 mũi (24giờ, 1tháng, 2tháng),vẫn có 41 trẻ bị nhiễm HBV mặc dù antiHBs(+) Dùng phương pháp PCR để khảo sát chuỗi gen của HBV ở những đứa trẻ này người ta thấy có một điểm đột biến trên vùng quyết định KN “a” của HBsAg so với HBsAg mẹ. Vùng thường xãy ra đột biến là ở vị trí a.amin 145. Đây là trường hợp chủng ngừa thất bại. Đột biến trên gen S còn tạo ra các phân typ HBsAg khác nhau
25. BiBiếếnn chchủủngng trêntrên vvùùngng HBsAgHBsAg
26. ĐĐộộtt bibiếếnn trêntrên DNADNA polymerasepolymerase Một số thông tin viết về biến chủng trên men DNA polymerase của HBV đã được ghi nhận Biến chủng này có liên quan đến việc sử dụng Lamivudine kéo dài Biến chủng này làm ngăn cản sự tương tác giữa thuốc với DNA polymerasecuar HBV, nhưng men này vẫn hoạt động bình thường
27. ÝÝ NGHNGHĨĨAA CCỦỦAA CCÁÁCC KHKHÁÁNGNG NGUYÊNNGUYÊN TRONGTRONG LÂMLÂM SSÀÀNGNG HBsAg Là dấu ấn đầu tiên của siêu vi xuất hiện trong huyết thanh bệnh nhân, khoảng 2 – 6 tuần trước khi có biểu hiện lâm sàng và 2 – 12 tuần sau khi tiếp xúc. HBsAg đạt đến nồng độ cao nhất tương ứng với thời kỳ vàng da rõ trên lâm sàng, sau đó giảm dần. HBsAg có thể (+) kéo dài từ 1 – 3 tháng và trở về (-) 5–10% trường hợp HBsAg biến mất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng 28% trường hợp (-) khi triệu chứng lâm sàng vừa cải thiện Do đó, khi HBsAg(-) vẫn không loại trừ tình trạng nhiễm HBV mà phải tìn thêm các marker khác (như anti HBc hoặc HBV DNA). Ngoài ra có thể tìm HBsAg trong mô gan bằng hòa mô miễn dịch hay miễn dịch huỳnh quang KN pre-S1 và KN pre-S2 xuất hiện sớm với nồng độ thấp, sau đó giảm song song với HBsAg. Các KN này còn phản ảnh tình trạng nhân đôi của siêu vi
28. ÝÝ NGHNGHĨĨAA CCỦỦAA CCÁÁCC KHKHÁÁNGNG NGUYÊNNGUYÊN TRONGTRONG LÂMLÂM SSÀÀNGNG HBeAg HBeAg được tổng hợp vượt trội trong giai đoạn nhân đôi của siêu vi,và là bằng chứng của tính lây nhiễm cao HBeAg không có ý nghĩa về mặt chẩn đoán khi HBsAg(+), nhưng nó lại có giá trị về mặt tiên lượng HBeAg tồn tại kéo dài trên 8 tuần sau khi bắt đầu có triệu chứng lâm sàng sẽ là dấu hiệu chỉ điểm sớm cho khả năng bệnh diễn biến sang giai đoạn mạn tính HBeAg thường(+) trong VGSV B mạn và hầu như (-) ở những người mang HBsAg mạn tính không triệu chứng Trong trường hợp có xuất hiện biến chủng pre-C thì HBeAg(-) nhưng antiHBe(+) và HBV DNA(+)
29. ÝÝ NGHNGHĨĨAA CCỦỦAA CCÁÁCC KHKHÁÁNGNG NGUYÊNNGUYÊN TRONGTRONG LÂMLÂM SSÀÀNGNG HBcAg HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu nên nó không được bài tiết ra khỏi tế bào gan, do đó không thể tìm thấy trong huyết thanh bệnh nhân
30. ÝÝ NGHNGHĨĨAA CCỦỦAA CCÁÁCC KHKHÁÁNGNG NGUYÊNNGUYÊN TRONGTRONG LÂMLÂM SSÀÀNGNG
31. ÝÝ NGHNGHĨĨAA CCỦỦAA CCÁÁCC KHKHÁÁNGNG NGUYÊNNGUYÊN TRONGTRONG LÂMLÂM SSÀÀNGNG HBV DNA HBV DNA(+) chứng tỏ siêu vi đang ở giai đoạn hoạt động nhân đôi trong tế bào kí chủ, cũng là bằng chứng của tính lây nhiễm cao Trong VGSV B cấp, HBV DNA biến mất trước hay cùng lúc với HBeAg, và trước khi HBsAg(-) HBV DNA còn có giá trị tiên lượng vì sự tồn tại kéo dài trên 8 tuần sau khi có triệu chứng lâm sàng sẽ là dấu hiệu chỉ điểm sớm cho khả năng bệnh diễn biến sang giai đoạn mạn tính Chỉ định của các phương pháp điều trị kháng virus thường dựa trên kết quả HBV DNA(+), và giúp đánh giá điều trị. Nồng độ HBV DNA tăng cao trước khi điều trị thường có đáp ứng kém với interferon.
32. ÝÝ NGHNGHĨĨAA CCỦỦAA CCÁÁCC KHKHÁÁNGNG NGUYÊNNGUYÊN TRONGTRONG LÂMLÂM SSÀÀNGNG
33. ÁÁPP DDỤỤNGNG TRONGTRONG ĐĐIIỀỀUU TRTRỊỊ INTERFERON Interferon α bắt đầu được sử dụng trong điều trị VGSV B mạn tính từ đầu thập niên 70, và sau đó nhanh chóng trở thành một phương thức trị liệu chủ yếu. Cơ chế tác dụng chủ yếu của Interferon α là Kháng siêu vi trực tiếp (như úc chế quá trình giải mã, ức chế quá trình xử lý protein, ức chế sự trưởng thành của siêu vi, ức chế quá trình sao chép) Điều hòa miễn dịch(IFN có tác dụng làm gia tăng khả năng trình diện KN trên bề mặt của tế bào gan để các lympho T gây độc cảm ứng ly giải các tế bào gan bị nhiễm HBV)
34. ÁÁPP DDỤỤNGNG TRONGTRONG ĐĐIIỀỀUU TRTRỊỊ
35. ÁÁPP DDỤỤNGNG TRONGTRONG ĐĐIIỀỀUU TRTRỊỊ INTERFERON
36. ÁÁPP DDỤỤNGNG TRONGTRONG ĐĐIIỀỀUU TRTRỊỊ CÁC THUỐC TƯƠNG TỰ NHƯ NUCLEOSIDE Sự phát triển của các thuốc tương tự như nucleoside thế hệ mới đã trở nên thuận lợi hơn nhờ những nghiên cứu của điều trị HIV Nhiều thuốc ức chế men sao chép ngược của siêu vi trong điều trị nhiễm HIV chứng tỏ có hiệu quả chống lại HBV Hiệu quả lâm sàng của Lamivudin trên bệnh nhân VGSV B được phát hiện tình cờ trong quá trình điều trị HIV ở nhóm bệnh nhân bị nhiễm cả HIV và HBV
37. ÁÁPP DDỤỤNGNG TRONGTRONG ĐĐIIỀỀUU TRTRỊỊ CÁC THUỐC TƯƠNG TỰ NHƯ NUCLEOSIDE Cơ chế tác dụng của các chất tương tự như Nucleoside Nucleoside là những đơn vị cấu tạo chuỗi RNA và DNA Các chất tương tự như Nucleoside là những chất tổng hợp có cấu trúc tương tự như nucleoside tự nhiên Cơ chế tác dụng của các thuốc có gốc này là ức chế quá trình tổng hợp DNA của siêu vi vì có khả năng cạnh tranh chỗ gắn kết của các nucleoside tự nhiên trên chuỗi DNA. Sau khi các chất tương tự nucleoside gắn vào chuỗi DNA rồi thì các nucleoside nội sinh kế tiếp của siêu vi không gắn kết được nữa. Vì vậy quá trình tổng hợp chuỗi DNA của siêu vi bị kết thúc nữa chừng.
38. XINXIN CCẢẢMM ƠƠNN QUQUÍÍ THTHẦẦYY CÔCÔ VVÀÀ CCÁÁCC BBẠẠNN ĐĐÃÃ QUANQUAN TÂMTÂM THEOTHEO DÕIDÕI